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qPCR

“El 95% de los toros positivos a Tricomoniasis fueron detectados en el primer raspaje”

La técnica diagnóstica brinda mayor sensibilidad para detectar a los toros positivos a Tricomoniasis bovina.

Por JC. Caione, D. Andreoli y Lic. P. Addamo 20 de mayo de 2023 - 00:00

La Tricomoniasis bovina es una enfermedad venérea, causada por el protozoo Tritrichomonas foetus (T. foetus). En las vacas, aunque la infección desaparezca luego de unos meses, es causante de baja tasa de preñez, repetición de servicios con celos irregulares, preñeces desuniformes y tardías. En el toro, la infección pasa inadvertida y es crónica, son portadores de T. foetus y reinfectan al rodeo, sobre todo los mayores a 5 años, ya que el protozoo invade el fondo de las criptas del prepucio, dificultando aun más su erradicación.
La técnica estándar para la identificación de las T. foetus es la observación por microscopio de medios de cultivos inoculados con la muestra, hay evidencia que este método presenta dificultades para distinguir el patógeno causante de Tricomonosis, de otros que habitan en el intestino.


Además, esta técnica se ve afectada por diversos factores como la temperatura y tiempo de transporte de la muestra, diversos medios de cultivos usados, el número de muestreos realizados, presencia de barro, heces y la cantidad de organismos inoculados por muestra.
La sensibilidad del diagnóstico veterinario por cultivo y microscopía a un solo muestreo en nuestro país es aproximadamente del 70%.
De allí que se deban realizar al menos dos muestreos consecutivos negativos con un intervalo no menor a los 15-21 días entre ellos como para considerar a un toro libre de la infección y hasta cuatro muestreos si el macho proviene de un rodeo donde la enfermedad es endémica.
El arribo de las técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), nos brinda mayor sensibilidad para detectar los toros positivos, aunque la cantidad de T. foetus inoculadas en el medio sean pocas o no tengan viabilidad.
En un principio se utilizaron protocolos de PCR convencional para confirmar los positivos por cultivo, migrando, posteriormente, a protocolos de PCR en tiempo real, que reducen los tiempos de análisis, permitiendo aplicar la técnica a un gran volumen de muestras.
McMillen, 2006, informa una sensibilidad más elevada de qPCR respecto a la PCR convencional para la detección T. foetus, pudiendo detectar hasta un solo flagelado en la muestra prepucial, con una sensibilidad 500 veces superior respecto a la técnica de cultivo seguido por el PCR convencional.
Por otra parte, estas técnicas reconocen una secuencia de ADN del patógeno, permitiendo distinguir otros microorganismos que no son de interés sanitario.
El objetivo de este trabajo es presentar estadísticas recopiladas por Laboratorio 9 de Julio con la técnica de PCR en tiempo real sobre la tasa de infección por T. foetus en los rodeos y toros.

Materiales y métodos

Durante el período 2020-2022 se analizaron 14.995 muestras prepuciales, correspondientes a 681 rodeos, de Entre Ríos, La Pampa, Córdoba, Santa Fe y, principalmente, Buenos Aires. Se llevó registro de las muestras, distinguiendo por rodeos y número de muestreo (1er y 2do).
Estas se analizaron por una PCR en tiempo real, con juego de primers dirigidos al gen 5.8s rARN y las regiones de espaciadores transcriptos internos (ITS) (Fellensein et al; 1998), el cual brinda mayor sensibilidad en la detección y la posibilidad de diferenciar T. foetus de microorganismos no patógenos.


Los resultados se interpretaron observando la curva de Melting y la curva de amplificación (Cq), considerándose positivas las muestras que amplifiquen a un Cq menor a 37 ciclos y muestren una temperatura de Melting entre 83 y 84 °C.
Resultados
De los 681 rodeos analizados, 73 (10,72%) resultaron positivos (Tabla N° 1).
Asimismo, de 14.995 toros estudiados 262 (1,7%) fueron positivos (Tabla N° 2).
Por otro lado, se pudo observar la capacidad de la técnica para detectar la enfermedad en el primer muestreo. Del total de positivos, 249 (95%) resultaron positivos en el primer raspaje, mientras que en el segundo sólo 13 (5%).
De esta manera en el presente reporte podemos confirmar un 95% de sensibilidad al primer raspaje (Tabla N° 3).

Conclusiones

La prevalencia de la enfermedad en la provincia de Buenos Aires va desde el 7% hasta 25% de rodeos infectados y 1% hasta 6% de toros positivos, con métodos de diagnóstico convencionales.
Según nuestros resultados, tomando los datos del año 2020 al 2022, por PCR en tiempo real el 10,72% de rodeos y el 1,7% de toros presentaron la enfermedad.


Considerando que hay un déficit de muestreos sucesivos, es imprescindible contar con una técnica de alta sensibilidad y especificidad. La técnica de qPCR demostró una ventaja en este sentido, ya que detecta el 95% de los positivos en el primer raspaje, mientras que por microscopía ronda el 70%.
Por otro lado, esta técnica presenta una ventaja muy destacada sobre el transporte de las muestras, debido a que las mismas pueden conservarse refrigeradas y/o congeladas por varios días, lo cual le permite al Médico Veterinario trabajar con comodidad y seguridad a la hora de conservarlas.
Otra ventaja no menor es que se requiere sólo un muestreo para las dos enfermedades venéreas (Tricomonosis y Campylobacteriosis), ya que las muestras son transportadas en un mismo tubo, haciendo la metodología muy práctica, segura y eficaz.

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