Buldain D1,2*, Gortari Castillo L1,2, di Filippo J1, Islan G3
1Laboratorio de Estudios Farmacológicos y Toxicológicos -LEFyT-, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata. 2CONICET. Argentina. 3Laboratorio de Nanobiomateriales, CINDEFI, Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata-CONICET (CCT La Plata), La Plata, Argentina. *[email protected]
Resumen
La resistencia antimicrobiana (RAM) es un problema mundial que requiere de nuevas alternativas de control. El aceite esencial (AE) de Melaleuca armillaris ha demostrado ser eficaz in vitro frente a S. aureus. Por otro lado, la aplicación de la nanotecnología permite incorporar moléculas a nanoestructuras, favoreciendo su protección, su liberación controlada y reduciendo la toxicidad. En este estudio, evaluamos la actividad AM del AE de M. armillaris libre, en combinación con cloxacilina, eritromicina, rifaximina y AE de Laurus nobilis; y encapsulado en transportadores lipídicos nanoestructurados (NLC) frente a S. aureus productor de biofilm. Se analizó la citotoxicidad del AE libre y nanoencapsulado sobre leucocitos polimorfonucleares (PMNs). El AE de M. armillaris resultó ser un fuerte AM frente a S. aureus productor de biofilm, y presentó sinergia en combinación con los antibióticos (ABs) mencionados y con el AE de L. nobilis. La encapsulación de este AE en las NLC permitió mantener su efecto AM y disminuyó el efecto citotóxico del extracto vegetal. Hallazgo sumamente importante para futuras evaluaciones de la actividad intracelular del AE en PMNs, en donde sobrevive el S. aureus, ya que nos permite pensar en potenciales aplicaciones en el control de infecciones de difícil resolución disminuyendo el uso de AMs y contribuyendo a la disminución de la diseminación de RAM como riesgo en el contexto de “Una Salud”.
1. Introducción
La creciente amenaza de la resistencia antimicrobiana (RAM) ha aumentado drásticamente el fracaso terapéutico y fomenta la exploración de nuevas alternativas para hacerle frente1. En el mundo mueren aproximadamente 700.000 personas por año debido a infecciones causadas por bacterias resistentes a múltiples antimicrobianos (AMs), se estima que este número llegará a alcanzar hacia el año 2050 cerca de 10 millones de muertes por año2. A esto debe sumarse la dificultad existente para el desarrollo de nuevas moléculas y el elevado costo que implica para la industria farmacéutica3,4. En Argentina, en el año 2015, se puso en marcha la Estrategia Argentina para el Control de la RAM (Res. 591/2015) de manera conjunta entre el Ministerio de Salud y el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca, que tiene como uno de los objetivos centrales “Promover la innovación en antimicrobianos”.
S. aureus es uno de los principales patógenos contagiosos responsable de ocasionar mastitis subclínica bovina, puede adaptarse, sobrevivir y crecer en la piel de la glándula mamaria y en las lesiones de los pezones, por lo que el principal reservorio son las ubres infectadas5. A su vez, las malas prácticas de manejo en el tambo, la falta de higiene de los establecimientos, los animales y el personal colaboran en la diseminación de este microorganismo. El uso de desinfectantes de pezones es una práctica de la rutina de ordeñe que permite reducir el número de nuevas infecciones intramamarias (IIM) en bovinos. Esta práctica es ampliamente aceptada como parte fundamental de un programa exitoso de control de mastitis6. Por otro lado, se cree que la supervivencia intracelular de este microorganismo contribuye a su recurrencia7. Esta bacteria es importante para la salud pública por su virulencia y por el riesgo potencial de transferencia de determinantes genéticos de RAM entre animales, humanos y el medio ambiente1, a tal punto que ha sido incluido en los programas de vigilancia y seguimiento de la resistencia a los agentes antimicrobianos como bacteria patógena zoonótica emergente (OIE, capítulo 6.7 del Código Sanitario para los animales terrestres).
Las dificultades para desarrollar nuevas moléculas antibióticas (AB) incitan a explotar diferentes estrategias dentro de las ya existentes8. Los aceites esenciales de plantas (AE) son mezclas complejas de metabolitos secundarios que junto con los AB pueden tener efectos sinérgicos9. Los diferentes compuestos presentes en los extractos vegetales dificultan que las bacterias desarrollen mecanismos de resistencia simultáneos frente a cada uno de ellos10,11. Melaleuca armillaris es una planta del género Melaleuca ampliamente cultivada, cuyo AE es rico en 1,8 cineol12. Se encontró actividad inhibitoria, in vitro, frente a varias especies bacterianas, incluido S. aureus13. El rendimiento obtenido de esta especie vegetal por nuestro grupo (1.55%)14,15 y la rápida regeneración de su biomasa tras la cosecha, hacen que su explotación sea económicamente viable y sostenible con un buen manejo. A esto debemos sumar la gran densidad de plantas que se puede cultivar por hectárea, una especie muy similar de Melaleuca (M. alternifolia), es cultivada industrialmente con densidades de 30000 plantas/Ha16, por lo que la cantidad de AE obtenida es muy importante. La terapia combinada, que asocia AB convencionales con compuestos naturales como los AEs, representa una estrategia prometedora para enfrentar la RAM17. Las combinaciones sinérgicas tienen mayor eficacia y menor toxicidad que sus componentes aislados. Diversos estudios que dan cuenta de la actividad sinérgica entre el AE y los AB14,18,19 sugieren que el aceite tiene potencial para usarse como adyuvante en la terapia antimicrobiana. De la misma forma, diferentes AEs pueden combinarse en busca de efectos sinérgicos.
Otro enfoque interesante para abordar el problema de la persistencia intracelular de S. aureus y la RAM asociados a las infecciones subclínicas y recurrentes de la mastitis bovina, es el desarrollo de nanoestructuras para el “delivery” de fármacos. Las nanopartículas penetran la membrana celular y los orgánulos subcelulares, se depositan en el sitio donde se ubica el microorganismo patógeno, permanecen a nivel intracelular por periodos prolongados y se liberan de su carga a través de los poros de las membranas de las mismas20. De este modo se favorece la actividad farmacológica, una dosificación uniforme del agente activo, aumentar su biodisponibilidad, localizarlo en el sitio infectado, disminuir el tiempo de tratamiento y los efectos secundarios21. Las matrices de las nanopartículas sólidas lipídicas (SLN) presentan características interesantes desde el punto biológico como citocompatibilidad, biodegradabilidad y estabilidad; mientras que los transportadores lipídicos nanoestructurados (NLC), presentan mejoras en las propiedades fisicoquímicas de las SLN, incluyendo una mayor estabilidad de almacenamiento de fármacos y eficiencia de encapsulación, como también un mejor control del perfil cinético de liberación de fármacos22. Por todo esto, la encapsulación de AEs en nanopartículas resulta sumamente prometedora en el mejoramiento de la eficacia de la terapia antimicrobiana, puesto que favorecen la estabilidad de estos, facilitan el manejo, mejoran su seguridad reduciendo los efectos secundarios tóxicos que pudieran presentarse, permiten una liberación controlada, mejoran la hidrosolubilidad de compuestos hidrofóbicos, mejoran biodisponibilidad y por lo tanto aumentan la eficacia23.
El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antimicrobiana del AE de M. armillaris frente a S. aureus mediante diferentes estrategias incluyendo la determinación de la actividad in vitro del AE solo, la combinación con antibióticos (eritromicina -ERI-, rifaximina -RIF- y cloxacilina -CLOX-) y AE de L. nobilis; encapsulado en nanopartículas tipo NLC, y la evaluación del efecto antibiofilm, citotoxicidad en células polimorfonucleares (PMNs) y su eficacia en un modelo de pezones escindidos.
2. Materiales y métodos
2.1. Obtención de AE de M. armillaris y su caracterización
Se recolectaron hojas y ramas herbáceas de plantas ubicadas en Coronel Brandsen, Buenos Aires, Argentina (latitud 35°06’18.9” S y longitud 58°10’57.0” O). Una alícuota se reservó para identificación y posterior almacenamiento en el herbario LPAG de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP24. El AE se obtuvo por destilación por arrastre de vapor de agua. La composición del AE fue analizada por GC-MS-FID y se evaluaron parámetros de control de calidad25: apariencia a 20 ºC, olor, sabor, color, índice de refracción, densidad, pH, solubilidad en aceite mineral (1:1), agua (1:10) y etanol 70% (1:1). Los índices de acidez y de esterificación se determinaron siguiendo la Farmacopea Argentina VII Ed (2013)26.
2.2. Evaluación de la concentración inhibitoria mínima y bactericida de cloxacilina, eritromicina, rifaximina y AE de M. armillaris
La CIM del AE y de los ABs se realizó por microdilución en caldo Mueller Hinton (CMH) utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos. Se añadió 0.5 % de Tween 80 para mejorar la disolución de AE. El pH del caldo se ajustó a 7.4, 6.5 y 5.0 mediante adición de ácido clorhídrico, emulando las condiciones de pH de los sitios a nivel extracelular e intracelular (citosol y fagolisosomal). El rango de concentraciones analizadas (doble dilución seriada) de AE fue 50-0.1 µL/mL, ERI 1024-0.007µg/mL, CLOX 512-0.007 µg/mL y RIF 256-0.007 µg/mL. En todos los casos, cada pocillo se inoculó con una concentración bacteriana final de 5×105 UFC/mL y se incubó a 35 °C durante 18-24 h. La CIM se estableció como la concentración más baja que inhibe el crecimiento bacteriano. Cada determinación se hizo por triplicado. Los controles positivos y negativos contenían CMH con Tween 80 (0.5%). La CBM se realizó inoculando 25 µL de cada pocillo sin crecimiento bacteriano evidente (post-CIM) en placas de agar nutritivo, incubadas a 35 °C durante 18–24 h para efectuar el recuento de colonias. La CBM se estableció como la primera concentración que produce la muerte del 99.9% del inóculo inicial.
2.2.1. Evaluación del sinergismo entre el AE de M. armillaris y antibióticos
Una vez establecidas las CIMs, se llevó a cabo la técnica de tablero de damas27 para las combinaciones de ABs y AE a pH 7.4, 6.5 y 5.0, con el fin de establecer la presencia o ausencia de interacción sinérgica entre ellos frente a S. aureus. El diseño de la microplaca constaba de una columna de dilución en serie en un factor de 2 de AB con una fila de dilución en serie en un factor de 2 de AE. Los pocillos adicionales contenían AB y AE combinados en diferentes proporciones que abarcaban todas las concentraciones evaluadas. Los inóculos se dispensaron considerando una concentración final de 5×105 UFC/mL por pocillo. Las microplacas, realizadas por triplicado, se incubaron a 35°C durante 18-24 h. Los resultados se interpretaron considerando el índice de concentración fraccionaria inhibitoria (CFI), definido como la suma de los cocientes entre la CIM de los AMs solos y combinados con el AE:
CFI=[(A)/(CIM)a]+[(B))/(CIM)b] Ec.1
Donde (A): CIM AB en combinación con AE; (B): CIM AE en combinación con AB; (CIM)a y (CIM)b: CIM del AB y AE solos, respectivamente. Así, existe sinergismo si CFI ≤ 0.5, sinergismo parcial o bajo (PS) si 0.5 < CFI < 1, indiferencia o adición (I) si 1 ≤ CFI < 2, y antagonismo (A) sí CFI ≥ 227.
2.2.2. Determinación del índice de actividad antibacteriana E y su modelización matemática
Se realizaron curvas de muerte bacteriana exponiendo los aislados de S. aureus a diferentes concentraciones de los ABs solos y combinados con AE a pH 7.4, 6.5 y 5.0. Las concentraciones se seleccionaron en base a la CIM obtenida en cada caso. Para el AE, los ABs y las combinaciones AE-ABs se utilizaron concentraciones de 0.5, 1, 2, 4 y 8 veces la CIM en todos los casos, excepto al evaluar cepas resistentes a ERI, donde las concentraciones fueron 0.5, 1, 2 y 4 veces la CIM a pH 7.4 y 0.5, 1 y 2 veces la CIM a pH 6.5 y 5.0, respectivamente, debido a que el elevado valor de CIM (particularmente en condiciones ácidas) para estas cepas dificultaba la solubilización del AB en los medios de cultivo.
Se preparó un tubo por cada condición a evaluar con un volumen final de 1 mL, integrado por CMH con Tween 80 al 0.5 % (pH 7.4, 6.5 y 5.0), AB e inóculo bacteriano (5×105 UFC/mL). Se incluyeron un control positivo (sin AB) y uno negativo (sin AB ni inóculo). Los tubos se incubaron a 35 °C, tomando muestras a las 0, 2, 4, 8, 12 y 24 h para efectuar conteo bacteriano en placa tras incubación a 35 °C por 24 h. El ensayo se realizó por triplicado para cada cepa. A partir de los datos obtenidos se evaluó el índice de actividad antibacteriana (E), definido como la diferencia en Log10 entre el recuento bacteriano (UFC/mL) al inicio (nt-0) y al final del ensayo (nt-24): E = (nt-24) − (nt-0). Se tomaron tres puntos de corte teóricos: efecto bacteriostático (E = 0), efecto bactericida (E = −3) y efecto de erradicación virtual de bacterias (E = −4)28. Se graficó el índice E frente a la concentración de ABs a efectos de comparar lo ocurrido en presencia y ausencia de AE.
Los valores del índice E vs. concentración de AB se modelaron matemáticamente utilizando un modelo sigmoidal similar a un modelo de respuesta máxima29,30 (Ecuación 2).
E = E0 − (Emax. Cγ)/(C50γ + Cγ) Ec. 2
Donde E es el índice E (Log10 UFC/mL) para una concentración C (µg/mL), E0 es el índice E en ausencia del AB (Log10 UFC/mL), Emax es la reducción máxima en Log10 de E0, C50 (µg/mL) es la concentración que provoca el 50% de la reducción de la Emax, y γ es el coeficiente de sigmoidicidad. Los datos experimentales se ajustaron con el modelo de regresión no lineal de mínimos cuadrados utilizando el software Sigma Plot 12.0 (2011). La C50 de los ABs solos se comparó con el mismo parámetro obtenido en las combinaciones con AE mediante la prueba t de Student para datos no apareados con un nivel de significación establecido en p <0.05. Se evaluaron los mismos parámetros para el AE solo, considerando la variación de pH.
2.3. Evaluación del sinergismo entre los AEs de M. armillaris y L. nobilis
Con el fin de evaluar una combinación natural alternativa para el AE de M. armillaris se utilizó AE de L. nobilis como adyuvante. La CIM y CBM del AE de L. nobilis fueron establecidas siguiendo el mismo procedimiento mencionado para el AE de M. armillaris. A partir de los datos de CIM y CBM de los AEs se evaluó la existencia de sinergismo entre ambos (según se describió en el punto 2.2.1). Los AEs fueron combinados en un rango de 50-0.09 µL/mL para cada uno, frente a S. aureus (n= 4) aislados a campo. La interpretación de los resultados se realizó a través del cálculo del CFI.
2.3.1. Evaluación antimicrobiana de la mezcla AE de M. armillaris y AE de L. nobilis sobre pezones bovinos escindidos
En base a los resultados de CIM, CBM y de sinergismo entre los aceites se evaluó una solución al 0.6% v/v (6 µL/mL) de cada uno. Se elaboraron dos formulaciones con distintas cantidades de agua destilada y alcohol etílico. Las formulaciones incluyeron, además de los AEs, agua destilada (diluyente), glicerina (emoliente), Tween 20 (surfactante para formar la emulsión) y alcohol etílico (disolvente). En la tabla 1 se presentan las formulaciones ensayadas. Como control se utilizó cada una de las 2 formulaciones sin el agregado de los AEs. Se seleccionó la formulación con la mezcla de los AEs que presentó mayor actividad antimicrobiana en menor tiempo para evaluar su eficacia mediante la técnica de recuento bacteriano utilizando pezones escindidos, obtenidos de vacas en una planta faenadora. Se limpiaron los pezones, eliminando el exceso de piel y tejidos con agua y jabón blanco; se desinfectaron con alcohol al 70% y se almacenaron en bolsas de nylon a -45 °C hasta su utilización.
Al momento del ensayo se prepararon 150 mL de inóculo de S. aureus ATCC 29213 al 0.5 de McFarland, (1-2 x108 UFC/mL). Para evaluar el poder germicida de la formulación sanitizante se utilizaron 20 pezones divididos en 4 grupos de 5 unidades cada uno: G1, control sin tratamiento; G2, solución fisiológica estéril; G3, formulación con AEs al 0.6% de cada uno (1x); y G4, formulación con AEs al 1.2% de cada uno (2x). Tras descongelar los pezones, estos fueron colgados de una varilla horizontal31,32, se sumergieron durante 10 seg. en solución fisiológica conteniendo el inóculo, y luego se dejaron escurrir 5 min. Posteriormente, los del G1 se limpiaron con un papel seco, y no se sumergieron en ninguna solución. A los del G2 se los sumergió en solución fisiológica, a los del G3 en la formulación 1x, y a los del G4 en la formulación 2x. La recuperación de bacterias sobrevivientes postratamiento se llevó a cabo mediante lavado con 10 mL de solución fisiológica estéril durante 20 seg. Las soluciones de lavado se diluyeron desde 1:10 hasta 1:100000; se sembraron 10 μL de cada dilución por triplicado sobre placa de agar nutritivo. Tras incubación a 35 °C por 18-24 h, se realizó el recuento bacteriano en placa. Se realizó un análisis bayesiano de comparación de medias con un intervalo de confianza del 95% utilizando el programa estadístico Epidat 3.1.
2.4. Síntesis de nanopartículas cargadas con aceite esencial de M. armillaris
Se prepararon transportadores lipídicos nanoestructurados (NLC) conteniendo AE de M. armillaris mediante sonicación. Brevemente, 400 mg de miristil miristato se fundieron en un baño de agua a 60–70°C y se mezclaron con 500 μL de AE y 50 μL de oleo croda. Después de 10 min, se añadió a la fase
lipídica una solución acuosa caliente (10 mL) con 3.0 % (p/v) de Pluronic® F68. Inmediatamente, la mezcla se sonicó durante 10 min (70 % de amplitud) utilizando un procesador ultrasónico equipado con una punta de titanio de 6 mm. Luego, la dispersión se enfrió a temperatura ambiente y se almacenó a 4°C. Adicionalmente se prepararon nanopartículas vacías de la misma forma, pero sin agregado de AE.
2.4.1 Actividad antimicrobiana de nanopartículas cargadas con AE de M. armillaris
Se evaluó la CIM de las nanopartículas vacías y cargadas con el AE de M. armillaris por microdilución en caldo según procedimiento descrito anteriormente. Se utilizaron 3 cepas SARM y 4 cepas SASM. El rango de concentraciones de AE analizadas (dilución seriada a la mitad) fue 12.5-0.02 µL/mL. Cada pocillo se inoculó con una concentración bacteriana final de 5×105 UFC/mL y se incubaron las microplacas a 35 °C durante 18-24 h. La CIM se estableció mediante el agregado de colorante vital resazurina y considerando la concentración más baja que inhibe el crecimiento bacteriano. Cada determinación se realizó por triplicado. Se determinó la CBM según se detalló en 2.2.
2.4.2. Actividad antibiofilm del AE de M. armillaris libre y encapsulado
Previamente, se determinó la capacidad de formar biofilm de las cepas SARM y SASM bajo estudio. Las mismas se cultivaron en caldo tripticasa soya (TSB) suplementado con glucosa al 1% (p/v) durante 24 h a 37 °C. Posteriormente los caldos de cultivo se diluyeron a una concentración equivalente al 0.5 de McFarland (1-2 x 108 UFC/mL) en TSB suplementado con glucosa al 1% (p/v). Se inocularon 200 μL de caldo de cultivo diluido en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano y se incubaron a 37 °C durante 24 h en condiciones estáticas. Tras la incubación se descartó el contenido de los pocillos y se lavaron con agua destilada, se secaron 30 min en estufa a 60 ºC. Luego se agregaron, en cada pocillo, 125 µL de solución de cristal violeta al 0.1% p/v para luego incubar 10 min a temperatura ambiente. Se vació la placa, se lavó dos veces con agua para remover el exceso de cristal violeta. Finalmente, para eluir el colorante incorporado por las células, se agregaron 200 µL de etanol 96° por 15 min. El contenido de cada pocillo se trasvasó a otra microplaca para determinar la absorbancia por espectrofotometría a 595 nm. Se comparó la capacidad de formación de biofilm respecto del control. El valor de corte por DO (DOc) se define como el valor de la media de los controles negativos más 3 desviaciones estándar. Las cepas se clasificaron como no productoras de biofilm (DO ≤ DOc); débiles (DOc < DO ≤ 2x DOc); moderadas (2x DOc< DO< 4x DOc) y fuertes productoras de biofilm (4x DOc < DO).
2.4.3. Inhibición de la formación de biofilm
Se evaluó la capacidad de inhibir la formación de biofilms, tanto del AE libre, AE encapsulado en NLC y NLC vacías. Microplacas de 96 pocillos fondo plano fueron cargadas con caldo TSB con glucosa 1% p/v, con inoculo bacteriano (1x108 UFC/mL) y la dilución correspondiente de NLC vacías y cargadas con AE; se incubaron estáticamente a 37 °C durante 24 h. Posteriormente, se retiró el medio de cultivo y cada pocillo fue lavado con PBS para eliminar las células planctónicas. El biofilm formado se tiñó con cristal violeta 0.1% p/v, y se lo solubilizó con etanol al 96 % para registrar su absorbancia a 595 nm. Se utilizaron controles positivos sin tratar (inóculo bacteriano y el medio de cultivo TSB con glucosa 1% p/v). El porcentaje de inhibición para cada tratamiento se calculó mediante la fórmula: (1 - A595/A595 del control sin tratar) x 100. Se estableció la CIMB50 frente al biofilm que se define como la concentración más baja que resultó en un 50 % de inhibición de la formación de biofilm.
2.2.4. Erradicación del biofilm formado
El efecto antibiofilm del AE de M. armillaris libre y encapsulado en NLC se determinó mediante la evaluación de la concentración mínima de erradicación de biofilm (CEMB50). La CEMB50 es la concentración más baja que erradica el 50% del biofilm preformado. Brevemente, se llevó a cabo la formación de los biofilms como se indicó anteriormente y fueron lavados con PBS estéril. Posteriormente se agregaron las diluciones de AE libre y encapsulado (preparadas en TSB con glucosa 1% p/v) en concentraciones correspondientes a 0.25, 0.5, 1, 2 y 4 veces la CIM de las nanopartículas cargadas con AE y 0.5, 1, 2, 4 y 8 veces la CIM de AE libre. Como control negativo se utilizaron pocillos cargados solamente con TSB más glucosa al 1% (p/v) estéril y como control positivo biofilms preformados con TSB con glucosa 1% p/v; se agregó también un control de nanopartículas vacías. Tras incubación a 37 °C durante 24 h en condiciones estáticas, se midió el efecto inhibidor con resazurina, tinción con cristal violeta y recuentos de UFC. Cada experimento se realizó por cuadruplicado.
2.4.5. Evaluación de la citotoxicidad del AE de M. armillaris encapsulado y libre frente a PMNs
Se aislaron PMNs a partir de sangre obtenida de bovinos sanos y que no recibieron tratamiento AB alguno durante los últimos 3 meses previos al ensayo. El protocolo fue aprobado por el CICUAL de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP (47.3.15J). Los PMNs aislados se resuspendieron en medio RPMI 1640, hasta alcanzar una concentración de 5x106 células/mL. Para ello, en un tubo cónico de vidrio estéril, se colocaron 3 mL de histopaque 1077, luego se agregaron 3 mL de sangre bovina completa, heparinizada, cuidando de no mezclar la sangre con el reactivo. Se centrifugaron a 400 g durante 30 min, así las células de la serie granulocítica se ubican entre el histopaque 1077 y los glóbulos rojos (ubicados en el fondo del tubo), mientras que los linfocitos, otras células mononucleares y las plaquetas se ubican en la zona entre el plasma y el histopaque 1077. Se extrajeron suavemente con una pipeta Pasteur estéril las capas superiores y luego se trasvasó a otro tubo cónico de vidrio para resuspenderlo en 5 volúmenes de PBS pH 7.4 estéril. Se centrifugó durante 15 min a 400 g, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 10 mL de cloruro de amonio (0.85%), agitando lentamente por 10 min para lisar los eritrocitos. Posteriormente, fue centrifugado a 400 g por 15 min, se extrajo el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 6 mL de PBS, para volver a centrifugar a 400 g por 10 min, y descartar el sobrenadante, finalmente se resuspendió en 4 mL de medio RPMI 1640.
Una vez aisladas las células, se efectuó el conteo celular y se evaluó la viabilidad de los PMNs utilizando una cámara de Neubauer. Las células aisladas fueron cultivadas en estufa a 37 °C en microaerofilia, corroborando la viabilidad cada 2 h durante 6 h. Para ello se colocaron 2 mL de suspensión celular (en RPMI 1640) en placas de 6 pocillos a una concentración de 5x105 PMNs/mL.
Posteriormente se expusieron las células al AE libre y encapsulado en diferentes concentraciones (las nanopartículas vacías fueron usadas como control). Para lograr la disolución del AE se adicionó 2.5 % v/v de DMSO al medio de cultivo. En el caso de las nanopartículas no fue necesario el agregado de DMSO para la solubilización. Las concentraciones de AE evaluadas estuvieron en el rango de 10-0.05 μL/mL. Se
evaluó la viabilidad de las células a las 0, 2, 4 y 6 h mediante la técnica de exclusión vital, descripta anteriormente. Para ello, a cada tiempo de muestreo una alícuota de 10 μL fue colocada en la cámara de Neubauer junto con el azul tripán. Además de evaluar el AE libre y encapsulado, se agregó un control positivo conteniendo PMNs disueltos en RPMI 1640 para comparar lo que sucedía en presencia de nanopartículas cargadas y vacías; y un control con adición de DMSO 2.5 %v/v para el caso de AE solo. Se graficó el porcentaje de supervivencia de PMNs respecto de los controles positivos correspondientes.
3. Resultados
3.1. Caracterización y evaluación de la actividad antimicrobiana del AE
Se obtuvieron 550 mL de AE (rendimiento: 1.55% v/p - volumen/100 g de material fresco). En el anexo se muestran la composición (Tabla 1A) y los parámetros fisicoquímicos analizados (Tabla 2A) del AE.
La CIM del AE de M. armillaris a pH 7.4 para todas las cepas evaluadas estuvo entre 6.25 y 12.5 μL/mL, observándose una ligera disminución al acidificar el medio. La CBM fue cercana a la CIM, con una relación CBM/CIM entre 1 y 4 indicando un efecto bactericida.
Al evaluar el índice E de actividad AB para el AE en función del pH del medio encontramos que a menor pH hay una ligera disminución de la concentración necesaria para lograr una misma reducción del inoculo inicial (Figura 1). Los parámetros farmacodinámicos obtenidos de la modelización matemática se presentan en la Tabla 2. Se observa, como punto destacado, la reducción de la concentración necesaria para disminuir en un 50% el recuento bacteriano (C50) a medida que el pH baja (p < 0.01).
3.2. Evaluación de la actividad antimicrobiana de cloxacilina, eritromicina y rifaximina con y sin AE de M. armillaris
Al evaluar la actividad de la CLOX encontramos que la CIM se ubicó entre 0.5 y 0.125 μg/mL, con una relación CBM/CIM < 4 (actividad bactericida), y disminución de estas concentraciones al bajar el pH del medio. Se observó un claro efecto sinérgico para la combinación AE/CLOX. Cuando enfrentamos la combinación AE/CLOX contra las cepas de S. aureus, hubo una gran disminución en la concentración de AB necesaria para inhibir el crecimiento incluso al acidificar el medio (Tabla 3). La actividad combinada AE/CLOX, también se evidenció en el efecto bactericida, establecido por el índice E. La disminución del inóculo inicial (Log10 UFC/mL) en un factor de 3 en 24 h marcó la actividad bactericida observada tanto para la CLOX sola como para la mezcla, siendo necesaria menor concentración de CLOX para alcanzar un efecto cercano a la erradicación virtual (E= −4) en presencia del AE. A su vez, con la modelización matemática del índice E vs. la concentración de AB (Figura 2, A, B y C), observamos que la C50 de CLOX también disminuyó, en forma muy significativa, respecto de la aplicación del AB solo (p < 0.001), y existió un efecto de adición con la acidificación.
La RIF presentó elevada actividad antimicrobiana frente a las cepas analizadas. La CIM fue 0.032 μg/mL sin variar al modificar el pH con una CBM de 2 a 4 veces mayor. Combinando RIF con AE de M. armillaris se encontró un efecto sinérgico particularmente a pH 6.5 y 5.0, en todas las cepas ensayadas (Tabla 5). A pH 7.4 se obtuvieron combinaciones que presentaron sinergismo parcial, con CFI = 0.56. En este caso se logró disminuir 16 veces la CIM de RIF con una disminución a la mitad de la CIM de AE con respecto a cada compuesto aplicado solo. A pH 6.5, la disminución de la CIM del AB fue menor (4 veces para las cepas salvajes y ocho veces para la cepa de referencia). Sin embargo, la caída en la cantidad de AE necesaria para potenciar la actividad antimicrobiana del AB fue aquí más evidente ya que, para todas las cepas, la disminución fue 4 veces la CIM del AE. Finalmente, a pH 5.0, la CIM de RIF disminuyó 8 veces para todas las cepas. En este último caso, la disminución de la CIM del AE es mucho más evidente ya que vuelve a disminuir por un factor de 4. Por lo tanto, como resultado de la reducción significativa de las concentraciones inhibitorias a pH 5.0, tanto del AE como del AB, los valores de CFI obtenidos fueron de 0.38, lo que muestra una importante sinergia entre ellos. Así, RIF tiene un efecto potenciado por la combinación con el AE y la acidificación del medio de cultivo.
Al analizar la disminución del inoculo bacteriano con el índice E es posible observar gráficamente cómo S. aureus se inhibe en mayor magnitud con menores concentraciones de RIF cuando está presente el AE (Figura 2, D, E y F). A pH 7.4 y 6.5, la RIF no fue capaz de producir por sí sola ningún efecto bactericida a las concentraciones analizadas, a diferencia de lo ocurrido a pH 5.0, mientras que su combinación con el AE de M. armillaris permitió lograr a concentraciones inferiores, efectos bactericidas cercanos a la erradicación virtual. Al aplicar el modelo sigmoidal a los datos del índice E vs. concentración de AB se observó que la presencia de AE permite disminuir la C50 de la RIF, en forma extremadamente significativa, alrededor de 10 veces, aún al variar el pH (p < 0.0001).
En el caso de ERI los resultados de CIM se encuentran en la Tabla 7. La CIM se incrementó al bajar el pH. La relación CBM/CIM para cepas sensibles a pH 7.4 fue de aproximadamente 64, 256 a pH 6.5 y a pH 5.0 fue >a 32. Para las cepas resistentes a ERI, la CBM se estableció en >1024 µg/mL. A pH 7.4 los 3 aislados resistentes presentaron valores de CFI de 0.56, en los que la cantidad de AB necesaria para la inhibición disminuyó 16 veces (1024 vs 64 µg/mL) en presencia de 6.25 µL/mL de AE. A pH 6.5, el coeficiente CFI fue inferior a 0.65 y la CIM del AB disminuyó al menos 8 veces (>1024 a 128 µg/mL) pero en presencia de 3.1 µL/mL de esencia, es decir, el AE disminuyó su CIM a la mitad. Finalmente, a pH 5.0 la situación fue muy similar a la observada a pH 6.5, ya que la CIM de ERI se redujo de >1024 a 128 µg/mL, con la diferencia de que la concentración de extracto vegetal fue aún menor (1.5 µL/mL).
Se modelaron matemáticamente las curvas del efecto antibacteriano E vs. concentración ERI a los 3 pH evaluados (Figura 2, G a L), obteniendo diferentes parámetros farmacodinámicos (Tabla 8). Para todas las cepas, la C50 de ERI aumenta con la acidez, en forma muy significativa a pH 5.0 (p<0.001). A su vez, la presencia de AE permite que la C50 de ERI sea significativamente menor que cuando se usa sola a los 3 pH evaluados (p <0.0001), ya que a pH 7.4 disminuye de 543.167 a 189.503 µg/mL con 12.5 µL/mL de AE. Para aislamientos resistentes con 4 CIM a pH 6.5 y 2 CIM a pH 5.0 se logran efectos bactericidas. A pH 7.4 se requiere una mayor cantidad de ambos para lograr este efecto. Una explicación podría ser que las cepas resistentes a ERI parecen ser más sensibles a pH inferiores a 7.4, donde Emax es menor para el control sin ABs de cepas resistentes en comparación con las cepas sensibles.
3.3. Evaluación de la actividad antimicrobiana de los AEs de L. nobilis y M. armillaris combinados
Los resultados de CIM, CBM y sinergismo para los AEs de M. armillaris y L. nobilis frente a S. aureus se presentan en la Tabla 9. En función de los resultados obtenidos en las pruebas de sinergismo se seleccionó la mezcla de 6 µL/mL (0.6%) de cada AE para evaluar formulaciones tópicas sobre pezones bovinos. Se elaboraron dos formulaciones (F) variando el contenido de agua destilada y alcohol etílico. La F1 contenía 25% de etanol y 70.8% de agua destilada, mientras que la F2 tenía 25.8% de agua destilada y 70% de alcohol. Ambas tenían 2% de glicerina y 1% de Tween 20. Ambas formulaciones fueron enfrentadas a un inóculo de 107 UFC/mL de S. aureus ATCC 29213. Tras 30 y 120 segundos de contacto no hubo desarrollo bacteriano con ninguna de las dos formulaciones. Pero el control sin AEs de la F2 (CF2) también inhibió el desarrollo de S. aureus.
La formulación seleccionada para continuar trabajando fue la F1, ya que presentó actividad bactericida por acción de los AEs y por su bajo contenido de alcohol etílico (25%). De este modo, la formulación a evaluar mediante la técnica de pezones escindidos fue: agua destilada (70.8%), Tween 20 (1%), glicerina (2%), etanol (25%), AE de M. armillaris (0.6%) y AE de L. nobilis (0.6%). Esta se aplicó tópicamente sobre pezones bovinos previamente desafiados con S. aureus ATCC 29213, cuyos recuentos bacterianos por tratamiento se grafican en la Figura 3.
Para los pezones control (sin tratamiento) el Log10 UFC/mL fue de 6.50 y con el uso de solución fisiológica este valor disminuyó a 4.54 UFC/mL, presentando diferencias significativas con el control sin tratamiento alguno (p<0.05). Al utilizar las formulaciones con AEs en concentraciones 1x y 2x el recuento de UFC/mL disminuyó a 3.62 y 3.47 respectivamente, siendo significativamente diferentes con el control y con el tratamiento de solución fisiológica (p<0.05). En cambio, entre las formulaciones con AEs 1x y 2x no existieron diferencias significativas en el recuento bacteriano (p=0.066).
3.4. Evaluación de citotoxicidad del AE libre y nanoencapsulado
El AE libre resultó ser citotóxico para los PMNs de manera inmediata a todas las concentraciones evaluadas. Solo una concentración de 0.05 μL/mL de AE permitió mantener PMNs viables después de 6 h, pero con una disminución del 90% con respecto al recuento celular inicial (Figura 4), mientras que la encapsulación disminuyó considerablemente la citotoxicidad del AE.
3.5. Evaluación de la actividad antimicrobiana del AE nanoencapsulado
El AE libre y nanoencapsulado demostró una CIM de 6.25 μL/mL frente a todas las cepas evaluadas; sin embargo, a concentraciones inferiores (0.3 μL/mL) presentó efectos inhibitorios sobre la capacidad de estas cepas de formación de biofilms en aproximadamente un 90% con respecto al control no expuesto. Todas las cepas tenían un CIMB50 de 0.3 μL/mL para el AE nanoencapsulado y libre (Figura 5 A y B, respectivamente). Las nanopartículas vacías utilizadas como control tuvieron un efecto inhibidor en la formación de biofilms, pero no en la inhibición del crecimiento bacteriano ni en la erradicación de biofilms. Por otro lado, el AE libre y encapsulado demostró eficacia para la erradicación de biofilms maduros (Tabla 10). En cambio, las NLC vacías fueron inactivas para erradicar biofilms.
4. Discusión
4.1. Características y actividad antimicrobiana del AE de M. armillaris
M. armillaris es una planta de estructura similar a la especie de M. alternifolia, de la cual es posible lograr plantaciones comerciales de 33000 plantas por hectárea33,34. El rendimiento en AE obtenido de 1.55% permite pensar en una buena rentabilidad para la producción de formulados fitoterapéuticos. El 1,8 cineol fue el componente principal (72.3%) hallado, similar a lo obtenido por otros autores12, 35, 36, siendo, en general, también el principal compuesto en el AE de las especies de Eucalyptus37. Falci et al. (2015) estudiaron la composición y actividad antimicrobiana del AE de una especie de Melaleuca (no especificada) cultivada en Brasil, que contenía 70.8% de 1,8 cineol, 8.95% de terpineol y 8.25% de limoneno38. Aunque no se especifica la especie de Melaleuca, se puede hacer un paralelismo con la composición del mencionado AE. Estos autores demostraron una importante actividad antimicrobiana frente a S. aureus con valores de CIM entre 1 y 2 µL/mL y CBM entre 2 y 4 µL/mL. Li et al. (2014) encontraron que la CIM del 1,8 cineol frente a S. aureus ATCC 25923 fue de 6.25 µL/mL39.
El alto contenido de 1,8 cineol puede ser uno de los factores que contribuyen a la actividad antibacteriana del AE. Se le ha atribuido como mecanismo de acción AB la permeabilización de las membranas en microorganismos como S. aureus debido a su gran hidrofobicidad40, 41. Yáñez Rueda y Cuadro Mogollón (2012) encontraron una importante actividad de esta especie frente a S. aureus ATCC 29213 (CIM de 12.4 µg/mL), en la que su composición era similar al AE de M. armillaris evaluado en este trabajo: 1,8 cineol (82.27%), limoneno (3.70%), α-pineno (3.16 %), terpineno-4-ol (1.4%), α-terpineol (1.2%), β-mirceno (1.12%) y α-terpineno (1.1%), entre otros42. Esto podría indicar un sinergismo entre estos componentes particularmente efectivo contra S. aureus. Analizando la CIM y CBM del AE encontramos que la relación CBM/CIM estuvo entre 1 y 4 (característico de los bactericidas43) manteniéndose la relación al acidificar el medio de cultivo. El mecanismo de acción del AE de M. armillaris contra S. aureus aún no se ha investigado. Hayouni et al. (2008) estudiaron la actividad AM de esta especie contra Lactobacillus35. Como el 1,8 cineol fue el principal componente encontrado (68.92%), los autores hipotetizaron que este compuesto podría desestabilizar la membrana citoplasmática de estas bacterias, como lo demostraron Li et al. (2014)39. Hayouni et al. (2008) también involucraron a los componentes minoritarios encontrados (α-pineno, terpineno-4-ol, y α-terpineno, entre otros) como responsables de la acción antimicrobiana35. Según estos autores, estas moléculas interactúan con la membrana celular, disolviéndose en la bicapa de fosfolípidos y desestabilizándola, aumentando la fluidez y por lo tanto, la permeabilidad pasiva.
La CIM y CBM son los parámetros farmacodinámicos más utilizados para cuantificar la actividad antibacteriana de un fármaco frente a un patógeno. Sin embargo, la evaluación temporal de diferentes concentraciones de un antimicrobiano frente a un microorganismo permite una mejor descripción de la magnitud de su efecto antibacteriano44. Evaluando el efecto antibacteriano (índice E) del AE se observa que mejora su actividad AM a menor pH. La modelización mediante la aplicación de un modelo sigmoidal nos permitió obtener diferentes parámetros valiosos, como la concentración necesaria para alcanzar el 50% del efecto máximo (C50). Este parámetro fue menor a menor pH frente a todas las cepas evaluadas, al igual que el Emax. Sin embargo, debemos considerar que el E0 también es menor; debido a que S. aureus es levemente sensible a pH ácido. El menor efecto antibacteriano máximo a menor pH puede estar influenciado por una menor capacidad de crecimiento bacteriano, coincidiendo con lo demostrado por Weinrick et al. (2004)45. A altas concentraciones, el efecto antibacteriano fue similar (y cercano a la virtual erradicación) para los tres pH, mientras que, a pH ácido, E0 fue menor, lo que afectó el valor de Emax.
El AE de M. armillaris también fue activo frente a los biofilms producidos por S. aureus, favoreciendo tanto a la erradicación de biofilms preformados como la inhibición de la formación de biofilms. La actividad antibiofilm de AEs está ampliamente reportada, pero no donde se utilice AE de M. armillaris. Es de esperar que la antibiótico resistencia del S. aureus aumente como resultado de la formación de biofilms con respecto a cultivos en suspensión46. En nuestro trabajo la CBM fue de 6 µL/mL, similar a la CEMB50.
4.2. Sinergismo entre el AE de M. armillaris y antibióticos
4.2.1. AE de M. armillaris y cloxacilina
Aún no existen trabajos publicados en los que se haya estudiado la interacción farmacológica entre el AE de M. armillaris y CLOX, aparte de los publicados por nuestro grupo14. En la bibliografía se encuentra mucha información acerca de la actividad antimicrobiana de otra especie de Melaleuca, M. alternifolia. El AE de esta planta ha sido investigado en busca de combinaciones sinérgicas, utilizando la técnica de tablero de damas frente a S. aureus. Sin embargo, los resultados obtenidos al combinar su AE con diferentes ABs como vancomicina47, tobramicina48 y ciprofloxacina49 arrojaron un efecto de indiferencia o antagonismo. Chaves et al. (2018) observaron la presencia de un efecto sinérgico entre el AE de Eucalyptus camaldulensis y betalactámicos como cefalexina, amoxicilina y ampicilina frente a cepas SARM50. Este AE presentó en su composición una concentración de 1,8 cineol, α-pineno y α-terpineol (76.93%, 7.15% y 2.39%, respectivamente) similar a nuestro AE de M. armillaris evaluado.
Se observó una disminución en el inoculo bacteriano inicial -Log10 (UFC/mL)- en un factor de 3 en 24 horas tanto para el AB solo como en la mezcla. Sin embargo, la concentración del AB en presencia del AE fue claramente menor. En un estudio realizado por Nascimento et al. (2007) el AE de Eremanthus erythropappus se evaluó en combinación con ampicilina frente a S. aureus, logrando un efecto bactericida sinérgico después de 24 h51. Con la modelización del efecto antibacteriano se puede observar como la concentración necesaria para lograr el 50% (C50) del efecto de caída del recuento bacteriano máximo (Emax) para CLOX disminuye en forma extremadamente significativa al acidificar el medio desde pH 7.4 a 6.5 y 5.0 (p < 0.0001). La disminución de la C50 de CLOX es mayor al adicionar al medio AE de M. armillaris, lo que nuevamente es potenciado en forma significativa a pH ácido (p < 0.0001).
En conclusión, fue posible reducir, in vitro, la concentración de CLOX necesaria para inhibir a las cepas de SASM y SARM mediante su combinación con AE. Considerando que CLOX es un AB del grupo de los betalactámicos con buena actividad frente a S. aureus y con amplio uso en medicina veterinaria, el AE aumenta el efecto antibacteriano de la misma incluso al pH intracelular ácido. Esto es un hallazgo muy importante para el tratamiento de infecciones intracelulares, en las que S. aureus se internaliza en los fagolisosomas, puesto que aumentaría la probabilidad de alcanzar el éxito terapéutico. El aumento de la susceptibilidad a los betalactámicos debido al pH ácido que prevalece en las vacuolas donde vive y prospera S. aureus, podría verse facilitado por la acción del AE de M. armillaris. El pH ácido provoca un cambio conformacional de la proteína diana de acción (PBP2a), aumentando la afinidad de su centro catalítico por el betalactámico44, 52. Estos hallazgos se convierten en una valiosa alternativa para el tratamiento de infecciones estafilocócicas persistentes. El AE de M. armillaris es una buena opción a considerar en el diseño de futuras formulaciones para evaluar los efectos in vivo, a fin de maximizar la eficacia de los ABs actuales y futuros.
4.2.2. AE de M. armillaris y rifaximina
En la bibliografía no se encuentran datos sobre combinaciones de ansamicinas con AEs frente a S. aureus, existen algunos reportes de extractos naturales con este tipo de fármacos, por ejemplo, Liu et al. (2018) encontraron una fuerte actividad sinérgica entre rifampicina y miel manuka frente a cepas de S. aureus productoras de biofilm53. Similar a lo hallado con las combinaciones CLOX/AE, para las mezclas RIF/AE se observó un efecto potenciado por la suma de dos factores: combinación de los ABs con el AE y acidificación del medio (emulando condiciones intracelulares donde se aloja S. aureus).
Con el análisis de los resultados de actividad antibacteriana en función de la concentración de RIF mediante el modelado matemático se puede observar que C50 es inferior en forma extremadamente significativamente para la combinación AE/RIF respecto de lo que sucede con el AB solo frente a S. aureus a los 3 pHs evaluados (p < 0.0001). La C50 de RIF fue 20 veces menor en presencia de AE a pH 7.4, pero a pH 5.0 la reducción es menor. Si bien la disminución de C50 es de menor magnitud al acidificar el medio, menor es la cantidad de AE utilizada (4 veces menos). La RIF demostró ser un AB potente frente a S. aureus, bajo nuestras condiciones experimentales. Estos resultados son hallazgos valiosos para el tratamiento de infecciones estafilocócicas de difícil resolución, considerando que por el avance de la RAM las opciones de tratamiento son cada vez más limitadas.
4.2.3. AE de M. armillaris y eritromicina
La combinación de AE de M. armillaris y ERI resultó interesante, especialmente en el caso de cepas de S. aureus resistentes a macrólidos. Estas cepas tuvieron valores muy altos de CIM (1024 µg/mL), perdiendo actividad antimicrobiana en condiciones ácidas. Pequeñas cantidades de AE de M. armillaris lograron disminuir significativamente la concentración requerida para inhibir a S. aureus con alta resistencia a ERI. Se ha encontrado sinergismo frente a S. aureus al combinar este AB con AE de Lippia alba54 y el extracto de Indigofera suffruticosa55. Magos et al. (2015) encontraron que la ERI es sinérgica con el carvacrol (terpeno que se encuentra en algunos aceites esenciales) contra los estreptococos56.
Existen varios mecanismos de resistencia desarrollados por S. aureus que afectan la actividad de los macrólidos57. En primer lugar, por la modificación del sitio diana por metilación o mutación, impidiendo la unión del AB a su diana ribosómica. Un segundo mecanismo implica la salida del AB y un tercero la inactivación del fármaco. La modificación de la diana ribosómica confiere resistencia de amplio espectro a los macrólidos, mientras que el eflujo y la inactivación afectan solo a algunas de estas moléculas58.
Es difícil establecer el mecanismo por el cual el AE de M. armillaris y la ERI ejercen un efecto sinérgico. El 1,8 cineol puede desintegrar la membrana celular y reducir el citoplasma, provocando daños en la estructura de S. aureus39. Una posible explicación de la sinergia entre el AE y la ERI sería que la desestabilización en la membrana, pared celular y una eventual disminución de la actividad de las bombas de eflujo aumentaría la llegada de AB al interior de la célula bacteriana, concentrándose aún más facilitando la interacción con el sitio de acción a nivel ribosomal. Piatkoswka et al. (2012), quienes estudiaron cepas de S. aureus resistentes a ERI, señalaron que la resistencia era consecuencia de una fuerte disminución de la permeabilidad de la pared celular a este AB57. Según estos autores, esta variante de los mecanismos de resistencia resulta ser la más eficiente, creando cepas más resistentes, con un valor de CIM superior a 1024 μg/mL. Las cepas altamente resistentes tendían a formar agregados más grandes y estables, indicando una diferencia en la composición de la pared celular con respecto a las sensibles, por lo que es posible que la actividad del AE tenga también implicaciones en la pared celular.
A los 3 pHs evaluados ERI se comportó como bacteriostática y con la adición de AE al medio de cultivo se obtuvieron efectos bactericidas. Esto también se reflejó en el análisis del índice E por modelado matemático. Es claro como la C50 de la ERI disminuye por la adición del AE. Teniendo en cuenta que los macrólidos pueden concentrarse a nivel intracelular, principalmente dentro de los macrófagos y PMNs59, la CIM y CBM de ERI combinada con el AE podría alcanzarse a nivel subcelular. Se ha reportado que la ERI puede acumularse entre 4 y 38 veces más a nivel intracelular que en el medio extracelular en macrófagos, 8 veces en neutrófilos PMNs y 6 a 12 veces en células epiteliales60. Por lo tanto, es factible alcanzar estos niveles, convirtiendo su combinación con AE de M. armillaris en una buena alternativa a evaluar para el tratamiento de S. aureus a nivel intracelular.
4.3. Actividad antimicrobiana de las nanopartículas NLC cargadas con AE de M. armillaris
No existen en la literatura trabajos que mencionen la encapsulación de AE de M. armillaris. La CIM del AE encapsulado en las nanopartículas NLC fue la misma que la obtenida al utilizar el AE libre, por lo cual la encapsulación no perjudica su actividad antimicrobiana en un cultivo en suspensión frente a S. aureus.
Saporito et al. (2018) obtuvieron un efecto similar al encapsular AE de Eucalyptus globulus61. Las NLC vacías lograron impedir la formación de biofilms de S. aureus aunque no tuvieron actividad antimicrobiana sobre bacterias en suspensión ni en la erradicación de biofilms preformados. Por otro lado, las NLC cargadas con AE resultaron tener una importante actividad tanto frente a S. aureus en suspensión como en la formación y erradicación de los biofilms, incluso para cepas SARM.
4.4. Citotoxicidad del AE de M. armillaris libre y nanoencapsulado
La determinación de la actividad intracelular del AE de M. armillaris frente a PMNs no ha sido reportada todavía en la bibliografía. El AE resultó ser citotóxico en un amplio rango de concentraciones (10-0.05 μL/mL). Caldefie-Chézet et al. (2006) encontraron que PMNs, aislados de humanos, expuestos al AE de M. alternifolia al 1% perdían un 50% en su viabilidad a las 2 h, mientras que frente a concentraciones del AE al 0.1% no había pérdida de viabilidad por lo menos durante dos h62. En cambio, utilizando células periféricas mononucleares humanas frente a 0.1 % del AE la viabilidad cae al 20% a los 30 min y a cero a las 3 h, pero frente a una concentración de 0.01% la viabilidad se mantiene incluso durante 24 h. En otro estudio, Tullio et al. (2012), evaluaron la actividad intracelular del AE de Thymus vulgaris frente a Candida albicans internalizada en PMNs humanos63. Las concentraciones del AE utilizado fueron de 0.25 y 0.5%, reportando actividad intracelular frente a C. albicans, sin embargo, no mencionan la realización de ensayos de viabilidad por efecto del AE sobre los PMNs. La reducción en el recuento de microorganismos podría ser el resultado de la muerte intracelular por el AM, lisis de las células fagocíticas con la liberación y posterior destrucción de los microorganismos por el AM extracelular, eliminación de microorganismos por AM residual después de la rotura de las células por sonicación al final del experimento y la estimulación de los mecanismos de destrucción intracelular por acción del AM64. En un trabajo posterior realizado por Tullio et al. (2019) se evaluó la toxicidad de los AEs de M. alternifolia y de “Mentha de Pancalieri” sobre PMNs, hallando que disminuía drásticamente su viabilidad con 0.25% de los AEs a los 30 min de haber sido expuestos63.
Una solución a este problema de toxicidad de los AEs sobre los PMNs es la nanoencapsulación a modo de “delivery” de moléculas al medio intracelular. Las nanopartículas penetran la membrana celular y los orgánulos subcelulares, depositándose en el sitio infectado, permaneciendo en forma intracelular durante tiempo prolongado y liberando su carga a través de los poros presentes en las membranas de las nanopartículas65. Existen nanomateriales capaces de incorporar una o más moléculas sin tener efecto sobre la carga de estas y aumentar así su acción farmacológica. Permiten una dosificación uniforme del fármaco, aumentar su biodisponibilidad, localizarlo en el sitio infectado, disminuir el tiempo de tratamiento y los efectos secundarios21. En este trabajo logramos disminuir la citotoxicidad del AE para células PMNs al incorporarlas en las nanopartículas NLC. Estas nanopartículas vacías mantuvieron la viabilidad en un 90% respecto del control sin tratar. En el caso de las NLC-AE la supervivencia fue de 70% a la concentración más baja evaluada (0.05 μL/mL) y de 30% a la concentración más alta evaluada (10 μL/mL). No se encuentra reportado el efecto de nanopartículas NLC sobre la viabilidad de células PMNs.
4.5. Sinergismo entre los AEs de M. armillaris y L. nobilis
El uso de desinfectantes de pezones es una práctica de la rutina de ordeñe que permite reducir el número de nuevas IIM en bovinos 6. La limpieza de la ubre pre-ordeño disminuye a niveles aceptables la contaminación en la piel del pezón, reduciendo la propagación de microorganismos, la incidencia de IIM y la cantidad de bacterias en la leche de tanque66.
Una recomendación importante para el desarrollo de soluciones predipping es que tengan una rápida actividad bactericida. Es deseable dejar un tiempo de contacto entre 15-30 segundos para que actúe el antiséptico y posteriormente corroborar que los pezones queden secos pasando sobre la punta de estos un papel individual descartable previo a colocar las pezoneras66. Este tipo de productos debe tener un amplio espectro de acción, no ser irritantes, ser humectantes, de baja viscosidad, tener estabilidad física y germicida, poca persistencia, no dejar residuos y poseer detergencia67. Los detergentes en la formulación favorecen la eliminación de materia orgánica y una mejor actividad del germicida. Por otro lado, los agentes humectantes penetran la piel del pezón, asegurando un contacto efectivo del antiséptico utilizado y maximizando la actividad germicida66. En la formulación desarrollada en este trabajo se utilizó Tween 20 al 1% como detergente, y como emoliente a la glicerina en un 2% (contribuye a mantener la humectación de la piel del pezón y es recomendable su uso en concentraciones de entre 2 y 8%67).
Entre los desinfectantes de pezones más utilizados se encuentran el Iodo, clorhexidina, amonio cuaternario, hipoclorito de sodio, cloro y peróxido de hidrógeno68. Sin embargo, varios estudios establecen el riesgo de aparición de resistencia cruzada entre desinfectantes y ABs utilizados en la terapéutica con mecanismos de acción similares69, 70. Es interesante encontrar alternativas a los antisépticos convencionales, siendo las plantas buena fuente de compuestos antimicrobianos. Se considera que un desinfectante efectivo debe lograr una reducción de al menos 3 logaritmos respecto del control sin desinfectar71. Con la formulación de AEs de M. armillaris y L. nobilis evaluada en este trabajo, frente a S. aureus, se observó una reducción de 2.88 Log10 UFC/mL utilizando los AEs a concentración 0.6% cada uno. Al duplicar la concentración de los AEs la reducción respecto al control fue de 3.03 Log10. Ganga Herrero (2014) evaluó mediante pezones escindidos inoculados, la capacidad germicida de formulaciones de cobre y de iodo frente a S. aureus, la formulación de cobre (2900 ppm) produjo una reducción de 6.86 Log10, mientras que las de iodo (6-8 ppm) lograron una disminución de 2.16 Log1072. Por otro lado, Leyton et al., (2013) evaluaron una alternativa fitoterápica, utilizaron un extracto de alfilerillo (Erodium cicutarium) con la que obtuvieron una reducción de más de 3 Log10 en ensayos in vitro y una disminución de más de un 70% en el desarrollo de UFC en la piel del pezón en estudios a campo73.
Los AEs tienen un gran historial en el estudio de sus propiedades antibacterianas sobre la piel humana, permitiendo controlar bacterias que colonizan el tejido e infectan heridas, incluyendo a S. aureus74. Los AEs de M. armillaris y L. nobilis resultaron ser sinérgicos frente a S. aureus, tanto para la actividad antimicrobiana inhibitoria como bactericida. El AE de M. armillaris está escasamente descripto en la literatura como se mencionó anteriormente. L. nobilis es una planta ampliamente utilizada como condimento y la demanda mundial es elevada75. Su adaptabilidad al cultivo en Argentina permite pensar en la explotación comercial de esta especie. En la localidad de Henderson (provincia de Buenos Aires) se evaluó la composición del AE de laurel durante todo un año observando poca variabilidad y encontrando como componente principal al 1.8-cineol76. Su actividad antimicrobiana está escasamente estudiada, pero hay trabajos que demuestran su actividad frente a S. aureus77. El uso de AEs en animales está ampliamente difundido para su aplicación en animales de granja, donde particularmente se aprovecha la actividad antimicrobiana de los mismos para desarrollar promotores de crecimiento como aditivos alimentarios78. En cuanto a las investigaciones para el control de IIM en bovinos con extractos vegetales los reportes se centran en la aplicación intramamaria (IMM) fundamentalmente79-81. Los trabajos acerca de la eficacia de la acción tópica para disminuir las IIM por reducción de la carga bacteriana de la piel de la ubre son escasos. Almeida Schiavon et al. (2011) evaluaron la acción antiséptica de un extracto hidroalcohólico de Tagetes minuta para post-ordeño en bovinos82. Este extracto no presentaba diferencias significativas en la reducción de nuevas IIM por Staphylococcus spp. y Streptococcus spp. en comparación con una formulación comercial de Iodo en ensayos a campo. Por otro lado, una formulación comercial tópica para la ubre bovina (Mastilep-gel, compuesto por extractos de Cedrus deodara, Curcuma longa, Glycyrrhiza glabra y Eucalyptus globulus) ha demostrado un importante efecto en vacas con mastitis subclínica, aumentando el volumen de leche producido y reduciendo el conteo de células somáticas79.
Los AEs de M. armillaris y L. nobilis demostraron ser sinérgicos entre sí y ser una interesante alternativa fitoterápica para la desinfección de pezones bovinos. Es necesario continuar con estudios de estabilidad de la formulación e incluir otros microorganismos que están presentes en el ambiente (por ejemplo, Escherichia coli), para finalmente evaluar su eficacia a campo y así poder promover su uso en los establecimientos lecheros.
2. Conclusiones
Nuestros resultados indican que el AE de M. armillaris presenta una fuerte acción antimicrobiana frente a cepas SARM y SASM formadoras de biofilm. La sinergia demostrada en combinación con CLOX, RIF, ERI y AE de L. nobilis permite pensar en potenciales aplicaciones en el control de infecciones animales de difícil resolución disminuyendo el uso de AMs convencionales y contribuyendo a la disminución de la diseminación de RAM como riesgo para la salud pública. La encapsulación de este AE en nanoestructuras como NLC no solo permite mantener la actividad antimicrobiana del AE, sino que también contribuye a disminuir la mortalidad de células PMNs por efecto del extracto vegetal. Hallazgo extremadamente importante para futuros experimentos que evalúen la actividad intracelular del AE en PMNs, donde S. aureus sobrevive escapando a la acción de los ABs poco penetrantes o poco eficaces a nivel subcelular. Como conclusión final el presente estudio demuestra que el AE de M. armillaris es una excelente alternativa natural al uso de ABs para maximizar la eficacia AM disminuyendo la diseminación de bacterias con RAM. Es un estudio de alto impacto tanto médico como biológico, a partir de una aplicación específica, que es la salud animal bajo el concepto de “Una Salud”. Este proyecto tendrá impacto tanto médico como biológico, a partir de una aplicación específica, que es la salud animal.
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BULDAIN-Manuscrito Premio ANAV - Biogénesis Bagó 2022.pdf
