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USO DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Y AGUA ULTRAPURA ARIUM

Secretos reproductivos de las plantas

La presencia de partículas contaminantes externas a las muestras pueden presentar también fluorescencia y crear «ruidos», interfiriendo con los resultados a lograr y provocando imprecisiones en la evaluación.
31 de agosto de 2014 - 23:20
Sistema de agua ultrapura arium® pro VF (fotografía cortesía de Sartorius). Sistema de agua ultrapura arium® pro VF (fotografía cortesía de Sartorius).

La citometría de flujo se desarrolló inicialmente para aplicaciones médicas, pero posteriormente demostró su utilidad en diferentes campos de la biología, en aplicaciones como el conteo y la clasificación celular, la detección de biomarcadores, etc. Aunque el primer artículo científico sobre análisis de núcleos vegetales mediante citometría de flujo se publicó en 1973, la irrupción de la CF en el análisis del ADN de las plantas se produjo a fines de los 80, cuando los investigadores comenzaron a aplicar la tecnología de manera habitual en plantas.

En la versión electrónica de este artículo (disponible en motivar.com.ar), podrán apreciar de manera esquemática cómo el citómetro de flujo alinea las partículas coloreadas o marcadas (con tamaños que van desde los 0,2 hasta los 150 mm, a través de equipos de detección electrónica, suspendiéndolas en una corriente de fluido dirigido hidrodinámicamente. En investigación vegetal, los núcleos (es decir, las partículas) se colorean con un marcador fluorescente (como DAPI [4 ‘,6-diamino-2-fenilindol]) o ioduro de propidio).

A continuación, los diferentes núcleos en suspensión se exponen a un haz de luz (normalmente láser o UV), y la dispersión generada de la luz es percibida por detectores que analizan la intensidad de la fluorescencia de cada partícula individual e informan sobre el contenido de ADN del núcleo. Datos sobre miles de núcleos intactos proporcionan información sobre el contenido de ADN de las células en los respectivos tejidos. Cada segundo es posible analizar de manera simultánea las características físicas o químicas de cientos de partículas, razón por lo cual la calidad y la pureza de las soluciones empleadas para la preparación y el examen de las muestran resulta crucial.

Histogramas de flujo de semillas hexaploides de R. carpaticola. El eje x representa la fluorescencia relativa de cada partícula medida; el eje y, por su parte, representa el número de partículas analizadas. a. Histograma de una semilla de origen apomíctico con una tasa de picos Em:En de 3,15. b. Histograma de una semilla de origen sexual con un índice entre picos Em:En de 1,48. Histogramas de flujo de semillas hexaploides de R. carpaticola.El eje x representa la fluorescencia relativa de cada partícula medida; el eje y, por su parte, representa el número de partículas analizadas. a. Histograma de una semilla de origen apomíctico con una tasa de picos Em:En de 3,15. b. Histograma de una semilla de origen sexual con un índice entre picos Em:En de 1,48.

Cuando se usa un sistema de suministro de agua de baja calidad o inadecuada, la presencia de partículas contaminantes externas a la muestra puede presentar también fluorescencia y crear «ruido», interfiriendo con los resultados y provocando imprecisiones en la evaluación.

El uso de agua ultrapura de gran calidad resulta, por tanto, obligatorio.

 

Producción de agua ultrapura de calidad ASTM clase I

Sartorius (Goettingen, Alemania) ofrece una serie de sistemas que producen agua ultrapura de calidad ASTM tipo 1. En el presente estudio, y con el fin de evaluar los efectos del uso de agua ultrapura (ArUPH2O) producida por el sistema arium® pro VF sobre la calidad de los resultados obtenidos en los análisis de citometría de flujo, examinamos las vías reproductivas empleadas por una angiosperma apomíctica facultativa para producir semillas. Lo hacemos utilizando ArUPH2O para correr las muestras y comparar los resultados con los obtenidos mediante el uso de la solución estándar de fluido envolvente (0,04 % de azida sódica, 0,01 % de detergente).

 

Descripción

El sistema arium® pro VF ha sido diseñado para producir agua ultrapura a partir de agua potable pretratada, y elimina cualquier contaminante presente aún en ella. La producción de agua ultrapura requiere una recirculación continua y un caudal de agua constante, que se consiguen a través de un sistema de bombeo con presión controlada.

La conductividad del agua se mide en el punto de entrada de la fuente de alimentación y en el puerto situado en el punto de salida del agua producida.

El sistema usado en las pruebas descritas en el presente artículo (modelo precedente y con el mismo diseño técnico que el actual sistema arium® pro VF) utiliza dos cartuchos distintos. Estos están rellenos de un adsorbente especial de carbón activo y resinas de intercambio iónico en soporte mixto, proporcionando agua ultrapura con un bajo contenido en carbón orgánico total (COT). Por otra parte, la unidad dispone de una lámpara UV integrada con efectos oxidante y bactericida a longitudes de onda de 185 nm y 254 nm, respectivamente. Además, el sistema de agua ultrapura arium® cuenta con un módulo ultrafiltrante integrado que se usa como filtro de flujo cruzado.

La membrana ultrafiltrante que utiliza retiene los coloides, los microorganismos, las endotoxinas, el ARN y el ADN. Un filtro final de 0,2 mm instalado en la salida del agua elimina las partículas y las bacterias durante la dispensación del agua ultrapura producida.

 

Resultados

Se reconstruyó la vía reproductiva de un total de 61 semillas individuales. A 30 de ellas se las analizó usando fluido envolvente, y en 31 se utilizó ArUPH2O (conductividad: 0,055 mS/cm o 18,2 MW x cm de resistividad compensada a 25 °C), siguiendo el procedimiento estándar recomendado.

Se analizaron en promedio 2.329 núcleos por muestra, lo cual representa el 73% del total de partículas contadas por muestra, el 27% restante estaba formado tanto por núcleos en fase G2 del ciclo celular como por señales espurias. Las posiciones medias del pico del embrión y el endospermo en cada una de las semillas analizadas se calculó en base al número medio de núcleos reunidos en cada pico. Las posiciones relativas de los núcleos en el eje x del histograma se basan en su ploidía relativa según el tejido de origen.

Tras determinar el índice entre picos, se estableció el origen reproductivo de cada semilla y la proporción de sexualidad y apomixis. Se emplearon distintos parámetros estadísticos para comparar los tratamientos en cada prueba y vía reproductiva, obteniendo valores absolutos del coeficiente de variación (CV%) para cada muestra individual, los rangos por prueba y vía reproductiva, además de los valores de asimetría para cada pico (tanto del tejido embrionario como endospermático) en todas las muestras apomícticas y sexuales.

A la vez, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para los valores medios de los picos de embriones y endospermos por muestra y tratamiento.

 

En resumen

El ArUPH2O puede utilizarse satisfactoriamente en citometría de flujo de células vegetales. A medida que la tecnología de citometría de flujo adquiere importancia en otras aplicaciones, como la detección de tumores celulares, la estimación cuantitativa y diferenciación morfológica de células, el análisis del ciclo celular, las estimaciones del contenido en ADN or ARN, las mediciones de apoptosis, etc., la idoneidad del ArUPH2O está abriendo nuevas puertas al agua ultrapura arium® en un gran número de aplicaciones que utilizan la emergente tecnología de la citometría de flujo.

 

Este artículo fue elaborado por el Dr. Diego H. Hojsgaard, Instituto Albrecht-von-Haller de Ciencias Vegetales, Departamento de Botánica Sistemática, Universidad de Goettingen (Alemania) y el Dr. Elmar Herbig, Sartorius AG, Goettingen; Alemania.

 

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